Bacillus thuringiensis باسیلوس تورنجینسیس

بر اساس گزارشات سازمان ملل ، حدود 800 ملیون نفر از جمعیت جهان ( 14 در صد ) دچار نفر فقر غذایی هستند که تا سال 2020 به یک میلیارد نفر خواهد رسید. از سوی دیگر ، بشر با استفاده نسبتا کامل از منابع و امکانات موجود ، امروزه برای افزایش تولیدات کشاورزی با محدودیت منابع موجه است . در این راستا ، فناوری زیستی یا بیوتکنولوژی – کشاورزی افقی روشن در برابر دیدگان ما می گشاید . تا شاهد دومین انقلاب سبز باشیم .

پیچیده ترین شاخه بیوتکنولوژی ؛ مهندسی ژنتیک Genetic Inginearing ، می باشد که روشهای مبتنی بر ژنتیک سلولی ملکولی ، نشانگرهای ملکولی ، کشت سلولی بافت ، میکروبیولوژی و بیوشیمی را در بر می گیرد . به طور کلی مهندسی ژنتیک شامل استفاده از روشهای انتخاب ژن مورد نظر ، جداسازی ، خالص سازی ، تکثیر و انتقال ژن ها و ارزیابی بروز آنها در موجود زنده می باشد .

یکی از مهمترین و کاربردی ترین استفاده های مهندسی ژنتیک در کشاورزی تراریزش یا انتقال ژن و تولید گیاهان و جانواران تراریخته transgenic Plant می باشد . این گیاهان دارای صفات جدید و یا تغییر یافته ای هستند که می توانند قابلیت مقابله با آفات را به طور اتوماتیک داشته باشند و این مسئله درآنها به حالت بالقوه در آید.

از سال 1901 که " ایشی واتا " باکتری شناس ژاپنی ، از بدن یک لارو مرده کرم ابریشم باکتری را جدا کرد تاکنون قریب به یک قرن است که مطالعات گسترده ای در زمینه تاثیرات و نحوه عملکرد و اثر این باکتری انجام می گیرد .

Bacillus thuringiensis یا BT نامی آشنا در کنترل آفات و حشرات است که در تولید بیش از 90% آفت کش های میکروبی و تعداد زیادی از گیاهان فراریخته مقاوم به حشرات کاربرد دارد ؛ به عنوان عاملی برای مبارزات بیولوژیک این باکتری یک باسیل گرم مثبت و اسپورزا است که به دلیل دارا بودن توکسین هایی که خواص حشره کشی دارند ، در مقابله با حشرات زیان آور کشاورزی ، بهداشت و محیط زیست جایگاه مهمی دارد .

توکسین های این باکتری که به " دلتا اندو توکسین " معروفند ، در حقیقت پروتئین های کریستالی هستند که هنگام اسپورزایی باکتری تولید می شوند . هنگامی که این توکسین توسط حشره بلعیده می شود .پروتئین کریستالی در محتویات و شیره قلیایی روده حشره حل شده و تحت تاثیر آنزیم های پروتئاز به قطعات کوچک تر تبدیل می شود . در اثر واکنش هایی که این قطعات با سلولهای اپی تلیال روده میانی حشره انجام می دهند ، دیواره روده حشره سوراخ شده و محتویات روده با هموسل مخلوط می گردد که این امر موجب بروز یک عدم تعادل بیوشیمیایی در بدن لارو می شود که برای حشره کشنده است . پس از جذب میزان کافی از توکسین و صورت پذیرفتن فعل و انفعالات مذکور ، لارو دست از تغذیه می کشد، در نتیجه ظرف چند روز از گرسنگی می میرد .

پژوهشها نشان داده است که این باکتری قابلیت استفاده علیه طیف وسیعی از آفات راسته های Lepidoptera, Coleoptera,dipter,Homoptera و حتی آفات غیره حشره مانند نماتد ها و پارازیتهای حیوانات اهلی را دارا می باشند .

چند مثال از کاربرد های BT:

- انتقال ژن BT به باکتری خاکزی Pseudomonas fluorescence

که با ریشه غلات و سویا همزیست می باشد و اضافه کردن این باکتری به خاک می تواند خسارت کرم اگروتیس یا شب پره زمستانی

(Agrotis ipsilon or Black cutworm ) در غلات را کنترل کند .

- انتقال ژن BT به یک ریز سازواره درونزاد Endophyte Microorganism که داخل دستگاه آوندی گیاهان زندگی می کند و تکثیر می شود و آغشته سازی بذور ذرت و برنج با آنها ، موجب کنترل کرم ساقه خوار ذرت و برنج می شود .

- آزمایشات مزرعه ای نشان داده است که ریزسازواره در خارج از گیاه زنده نمی ماند و به گیاهان تلقیح نشده همجوار نیز منتقل نمی شود . بنابر این مشکل زیست محیطی نخواهد داشت .

در پایان باید یاد آور شد که استفاده از روشهای مبتنی بر مبارزات بیولوژیک با آفات به جای استفاده از سموم شیمیایی هم از نظر حفاظت محیط زیست بسیار حائز اهمیت است و هم از نظر صرفه جویی اقتصادی کشاورزان ، به عبارتی می تواند بهینه سازی مبارزه و کنترل آفات باشد .

 

 

 SDS     SDS-PAGE"  پروتئین ها"

سيستم بافري ناپيوسته Non continous كه توسط "Laemmmli" در سال 1970 معرفي شد، رايج ترين روشي است كه براي بعد دوم الكتروفورز دوبعدي بكارگرفته مي شود. ژلها يا داراي غلظتي مشخص از پلي آكريلاميد يا حاوي شيبهاي غلظتي از پلي آكريلاميد هستند. نوارهاي "IPG" بعد از متعادل سازي مستقيماً بر سطح ژلهاي بعد دوم "SDS-PAGE" قرار داده مي شوند كه اين ژلها مي توانند عمودي يا افقي باشند.

در مورد روشهايي كه از سيستم هاي افقي براي بعد دوم استفاده مي شود اين مزيت وجود دارد كه چون ژلهاي "SDS-PAGE" بر روي يک صفحه ي پلاستيكي متصل هستند, در نتيجه از تغييرات در اندازة ژل در حين رنگ‌آميزي ممانعت بعمل مي آيد. در روش افقي نقاط در مقايسه با آن چيزي كه از سيستم عمودي گرفته مي شود داراي وضوح بيشتري هستند. اين امر به دليل قطر کمتر ژلها مي باشد كه معمولاً در سيستم افقي 5/0 ميلي متر است درحاليكه در سيستم عمودي بين 5/1-1 ميلي متر است. قطر کم استفاده از ولتاژهاي بالاتر را ممکن مي سازد و درنتيجه انتشار پروتئينها در حين الکتروفورز كمتر است. اما مزيت ژلهاي "SDS-PAGE" عمودي در امکان انجام چندين تجربه به طور هم زمان است که درآناليز پروتئوم کمک به افزايش تكرارپذيري نمايه ي پروتئيني الكتروفورز دوبعدي را مي نمايد. در سيستم هاي عمودي نياز به استفاده از ژلهاي رديف کننده Stacking نيست زيرا مناطقي كه پروتئينها در آن فوكوس شده اند در داخل نوارهاي IPG قبلاً تغليظ شده‌اند.

"SDS-PAGE" علاوه بر استفاده گسترده در الکتروفورز دو بعدي, يكي از قابل اعتمادترين روشهاي موجود براي جداسازي پروتئين در مخلوط هاي پروتئيني و نيز ارزيابي خلوص پروتئين است. كاربردهاي ديگر "SDS-PAGE" كه در تحقيقات مربوط به تعيين ساختار پروتئين و پروتئوميكس مطرح مي شود عبارتند از:

  • تعيين جرم مولكولي نسبي (Mr)

  • مشخص كردن غلظت پروتئين

  • شناسايي تغييرات پروتئين

  • تعيين نقشه پپتيدي با استفاده از هضم پروتئوليتيك جزئي در ژل رديف کننده.

  • مرحلة اول ايمونوبلاتينگ با انتقال الكتروفورتيك به ماتريكس

  • تلفيق با روشهاي پروتئوليتيك با توان عملكردي بالا براي توالي يابي مستقيم پايانه هاي كربوكسي ـ آميني و يا تلفيق هضم پروتئوليتيك بر روي ژل و اسپكتروفوتومتري جرمي براي تعيين هويت پروتئين است.

اگرچه اكثر محققان هنوز از روش تكنيك هاي رنگ آميزي كوماسي برليانت بلو ،‌ نيترات نقره و همچنين برچسب هاي راديواکتيو استفاده مي كنند، استفاده از روشهاي پيشرفته جديد با حساسيت بالا در بصري سازي پروتئين بخصوص روشهاي رنگ آميزي فلورسانس ، حساسيت كلي آشكارسازي پروتئين ها را در روي ژل پلي آكريل آميد بالا برده است.

سديم دودسيل سولفات"SDS" يک دترجنت آنيوني است که به اغلب مولکولهاي پروتئيني در محلول هاي مايي و درpH هاي متفاوت متصل مي شود. "SDS" تقريبا" به همه ي پروتئينها با نسبت تقريبي 4/1 گرم در 1 گرم پروتين اتصال مي يابد. براي همين "SDS" باعث القاء بار الکتريکي منفي متناسب با اندازه در پلي پپتيدها ميگردد. علاوه بر اين "SDS" با تخريب پيوندهاي هيدروژني و بر هم کنش هاي هيدروفوبي, باعث تخريب ساختمان دوم و سوم پروتئين ها مي گردد. در صورت حضور يک ماده ي احيا کننده نظير "DTT" پيوندهاي دي سولفيدي از گسسته وتاخوردگي پروتئين ها به طور کامل از بين مي رود. پلي پپتيدهايي که شکل طبيعي اشان توسط "SDS" بر هم خورده و احيا هم شده اند به شکل ميله هايي انعطاف پذير در مي آيند که داراي بار منفي يک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتريکي به جرم مولکولي در اين پلي پپتيدها تقريبا" نسبتي مشابه است, جداسازي پروتئين ها در الکتروفورز تحت چنين شرايطي تقريبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولي آنها است.

برخي پروتئين ها در "SDS-PAGE" رفتاري غيرعادي دارند به خصوص برخي گليكوپروتئين ها به مقادير عادي از "SDS" متصل نمي شوند, در نتيجه نسبت بار الکتريکي به وزن مولکولي در آنها مشابه اين نسبت در پروتئين هاي ديگر نيست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتيجه وزن مولکولي بيشتري از خود نشان خواهند داد.

پروتئين هايي با بارمنفي زياد و يا با بار مثبت زياد, مثلا" هيستون ها, يا پروتئين هاي غني از پرولين, مثلا" كلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غيرطبيعي وزن مولکولي بالايي از خود نشان مي دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازي پروتئين هايي با جرم مولكولي خيلي مشابه كه داراي تغييرات بعد از ترجمه, نظير استيليشن يا متيليشن يا فسفروريليشن, هستند از ارزش کمي برخوردار است. براي آناليز چنين پروتئين هاي تغيير يافته اي ، از روش PAGE با اوريک اسيد استفاده مي شود كه در آن هم وزن مولكولي و هم بار پروتئين در فرآيند جداسازي دخيل است . پروتئين در pH اسيدي بار مثبت دارد و در ميدان الكتريكي به سمت كاتد حركت مي كند . به اين دليل از روش PAGE اسيداوره عموماً براي جداسازي پروتئين هايي با سايز يكسان و بار متفاوت استفاده مي شود.