قارچ ها را بهتر و کاملتر بشناسید شوره سر یا Pityrosporosis را بهتر بشناسید

قارچ ها

تعریف قارچ ها

Fungi= قارچ

قارچ ها =Fungus

قارچ ها ارگانیسم های یوکاریوتیک(Eukaryotic) تک سلولی و یا چند سلولی بوده که در محیط های مرطوب و تاریک بهتر رشد می کنند.

از نظر شکل، ساختمان و اندازه با باکتری ها تفاوت دارند.
از نظر اندازه از باکتری ها بزرگترهستند.
به شکل رشته ای، گرد یا بیضی و ... می باشند.
قارچ ها بر خلاف باکتری ها مورد تهاجم باکتریوفاژها قرارنمی گیرند.

قارچ‌ها نه جانورند و نه گیاه؛ بلکه دسته‌ای جداگانه از یوکاریوت‌ها را تشکیل می‌دهند. این دسته همگی دگرخوار (هتروتروف) بوده و برای رشد و تکثیر به ترکیبات آلی جهت اخذ انرژی و کربن نیاز دارند. قارچها هوازی یا ناهوازی اختیاری هستند. اکثر قارچها گندروی (ساپروتروف) بوده، در خاک و آب به سر می‌برند و در این نواحی، بقایای گیاهی و جانوری را تجزیه می‌کنند. قارچها مانند باکتری‌ها در تجزیهٔ مواد و گردش عناصر در طبیعت دخالت داشته، حائز اهمیتند. علم مطالعهٔ قارچ‌های انگل برای انسان را قارچ‌شناسی پزشکی گویند (این انگلها بیماریهای زیادی را به وجود می‌آورند).

قارچ‌ها تأثیر زیادی در طبیعت دارند. گونه‌ای از قارچ‌ها با تخمیر انگور آن را تبدیل به شراب می‌کند. گونه‌ای دیگر انگورها را بر روی تاک می‌کُشد. گونه‌ای دیگر باعث سیاه شدن رنگ کاشی‌های حمام می‌شود و گونه‌های دیگر قارچ، باعث ایجاد یا درمان بیماری می‌شوند یا باعث پوسیدگی چوب یا رویش دوبارهٔ ریشهٔ گیاه می‌شوند.^[۱] قارچ‌ها بر خلاف گیاهان نمی‌توانند خوراک خود را تولید کنند؛ بنابر این برای ادامهٔ زندگی ناچارند مصرف کننده باشند (هتروتروف)

قارچ در لغت فرس هم معنی با «کارز» آورده شده که تلفظ دیگر رایج در فارسی بود. نام دیگر آن سماروغ بوده‌است. مردم عادی به آن «کلاه دیوان» و «چتر مار» هم می‌گویند.

دسته‌بندی:

قارچها انواع خوراکی نیز دارند. قارچهایی که در مناطق صحرایی می‌رویند، اغلب خوردنی‌اند. سلسلهٔ قارچها به دو شاخهٔ قارچ‌های کاذب و قارچ‌های حقیقی تقسیم بندی می‌شوند. قارچ‌های حقیقی خود به پنج زیر شاخه تقسیم می‌شوند که عبارتند از: ماستیگومایکوتا، زیگومایکوتا، آسکومایکوتا، بازیدیومایکوتا و دئوترومایست. قارچ‌های خوراکی جزء زیرشاخه بازیدیومایکوتا هستند. بعضی از قارچ‌ها با تثبیت نیتروژن به گیاهان کمک می‌کنند و بعضی دیگر به خاطره داشتن این ویژگی با گیاهان به طور همزیست زنگی می‌کنند.

قارچهای خوراکی از لحاظ نوع تغذیه‌شان به دو دستهٔ: تجزیه‌کنندهای اولیه و تجزیه‌کنندههای ثانویه تقسیم می‌شوند:

تجزیه‌کننده‌های اولیه به دسته‌ای از قارچها اطلاق می‌گردد که توانایی تجزیهٔ سلولز و بقایای مردهٔ گیاهی را دارند؛ اما تجزیه‌کننده‌های ثانویه برای رشد و تغذیه به محیطی احتیاج دارند که قبلا توسط ریزسازواره‌ها تجزیه شده باشند.

طبق طبقه‌بندی فوق قارچهای Agaricus SPP. و Volvariella SPP. در دستهٔ قارچهای تجزیه کنندهٔ ثانویه و Polurotus SPP.

و (Shitake)Lentinus SPP. در دسته قارچهای تجزیه کنندهٔ اولیه قرار می‌گیرند. قارچ‌های سمی متعددی نیز در طبیعت رویش دارند. تغذیه از این قارچ‌ها منجر به بروز علایم متعدد روانی و جسمی تا مرگ می‌گردد

بیماری‌های قارچی:

قارچها (به خصوص مخمرها) موجب برخی بیماریها در انسان مانند کچلی مو و ناخن، کریپتوکوکوزیس و کاندیدیازیس می‌شوند.

 

تقسیم بندی قارچ ها از نظر مورفولوژی

الف- قارچ های رشته ای (Molds) در زیر میکروسکوپ به صورت رشته هایی به نام (Hyphae) دیده می شوند. مجموعه رشته های هیف را میسلیوم (Mycelium)
می نامند که دارای انشعابات زیادی می باشد.
قارچ های رشته ایبه دو دسته تقسیم می شوند:
1- قارچ های رشته ای بدون تیغه میانی (Aseptate hyphae) یازایگومیست ها
2- قارچ های رشته ای با تیغه میانی (Septate hyphae )
ب- مخمرها (Yeasts): ارگانیسم های تک سلولی، گرد، بیضی و دارای دیواره سلولی نازک یا ضخیم می باشند که به دو روش جوانه زدن و تقسیم دوتایی که نوعی روش تولید مثل غیر جنسی است، تکیثر می نمایند. مخمرها کلنی خامه ای دارند و از طریق جوانه زدن تولید بلاستوکوونیدی می نمایند که از پهلوی هم قرار گرفتن بلاستوکونیدی یا طویل شدن آنها در صورت کاهش آکسیژن محیط،، کاهش قند و یا در حضور پروتئین ها به فرم رشته ای تبدیل می شوند که به آنهاهیف کاذب (Pseudohyphae) می گویند. مثل کاندیدا ها که بیماریزا می باشند.

اهمیت اقتصادی قارچ
قارچ هاوجوه مشترک فراوانی با گیاهان و آغازیان دارنداما قارچها از بسیاری جهات چنان با سایر جانداران متفاوت هستند که بیشتر زیست شناسان آنها را در سلسله مجزا قرار می‌دهند. قارچها زندگی بسیار موفقیت آمیزی دارند. تقریبا در همه زیستگاههای در دسترس که روی زمین وجود دارد، یافت می‌شوند و بسیاری از آنها از لحاظ اقتصادی و پزشکی حائز اهمیت می باشند.

جنبه‌های مفید قارچها

قارچها همراه با باکتریها می توانند قندها، آمینواسیدها و پروتئین ها را تجزیه کنند.
عده‌ای از قارچهای کلاهک ‌دارخوراکی(Mushroom) در تغذیه نقش مهمی دارند.

اهمیت قارچ ها در صنایع دارویی:کشف خواص آنتی بیوتیکی پنی سیلین اولین بار در سال 1925 توسط الکساندر فلیمینگ که در بیمارستان سنت ماری در لندن روی قــــارچ پنی سیلیوم نوتاتوم تحقیق می‌کرد، صورت گرفت. پس از آن از قارچ ها در ساختن آنتی بیوتیک هایی نظیر پنی سیلیوم نوتاتوم(P.nutatum)در ساخت پنی سیلین، پنی سیلیوم گریزئوفولومP.griseofulvum)) در ساختداروی ضد قارچی گریزئوفولـوین (Griseofulvin) استفاده شد و از پنیسیلیوم کریزوژنوم آنتی بیوتیکی استخراج شد که قادر به مهار رشداستافیلوکوک ها می باشد
 

نحوه زندگی قارچ ها:

1 .زندگی همزیستی:

سیمبیوزیس(Symbiosis) زندگی مسالمت آمیز با دیگرموجودات مثل همزیستی قارچ با جلبک و قارچ با غلات که منجر به جذب و تثبیت نیتروژن و مواد معدنی و آلی در گیاهان می گردد.

2.زندگی همسفرگی: کومنسالیسم(Commensalism): شکلی از همزیستی که دو ارگانیسم به طوری درارتباطند که یکی سود می برد و دیگری نه سود و نه ضرر مثل مخمرهای دستگاه گوارش.

3.زندگی ساپروفیتی: اکثر قارچها ساپروفیت هستند و در خاک و آب بسر برده و مواد غذایی خود را از مواد آلی که روی آن زندگی می کنند بدست می آورند.

4-زندگی انگلی:که در خارج یا داخل بدن میزبان می توانند زندگی کنند در نتیجه ممکن است موجب بیماری شوند.

ادامه مطلب اهمیت قارچ ها در صنایع دارویی:


قارچها در فرایندهای صنعتی وغذایی نظیر تهیه نان و پنیر نقش مهمی دارند بطوری که از پنی سیلیومکاممبرتی ( P. camemberti) در تهیه پنیرهای خوش طعم کاممبرتاستفاده می شود. قارچهایی که مواد قندی را تخمیر می کنند، قارچ های قندی یا ساکارومیست(Saccharomycet) نامیده می شوند. از قدرت تخمیری قارچهای قندی در ایجاد الکل، گازکربنیکو تخمیر مواد در صنایع استفاده می شود.

ارزش غذایی مخمرها به علت داشتن مقدار قابل توجهی اسیدهایآمینه، ازت، فسفر، ویتامینهای C و D است. در کشور چین به عنوان جبران مواد پروتئینی، به جیره غذایی افراد از این قارچها اضافه می‌کنند. امروزه ازآسپرژیلوس نیجر(Aspergillus niger)در ساخت الکل و اسید سیتریک استفاده می شود.

فرآورده‌های مختلفی از قارچها نظیر اسید هایآلی (اسید سیتریک، اسید گلوکونیک) بدست می‌آید.همچنین از قارچها در تهیه هورمونها وویتامینهایی از قبیل ریبوفلاوین، بتاکاروتن و در تهیه آنزیمهایی نظیر پروتئازها ، آمیلازها و پکتینازها استفاده می‌شود. ماده دارویی افدرین نیز از قارچها تهیه می‌شود.

برخیاز قارچها با انجام فعالیتهای شیمیایی و تجزیه مواد در خاک اقدام به Detoxification) سم‌زدایی(می‌کنند.

اختلاف هیف حقیقی در قارچ های رشته ای و هیف کاذب در مخمرها:


هیف کاذب در نتیجه طویل شدن بلاستوکونیدی (جوانه) بدون جدا شدن از سلول مادرایجاد
می گردد.
در شاخه های جانبی هیف کاذب،جدارعرضیدر نقطه انشعاب وجود دارد.

سلول انتهایی هیف کاذب معمولاً گرد می باشد.

بین سلول های هیف کاذب جریان سیتوپلاسمیک برقرار نمی باشد.

در صورتی که هیف حقیقی در نتیجه طویل شدن لوله زایا که از رویش اسپور حاصل می شود،
ایجاد می گردد.

در شاخه های جانبی هیف حقیقیجدارعرضیدورترازمحل انشعاب قرارگیرد.

بین سلول های هیف حقیقی جریان سیتوپلاسمیک برقرار می باشد.

سلول انتهایی هیف حقیقی معمولا“ استوانه ای شکل است.

ج- قارچ های دوشکلی (Dimorphic): این قارچ ها بالقوه بیماریزا هستند و نیاز به شرایط خاصی ندارند. این قارچ ها هم به صورت مخمری و هم به صورت رشته ای دیده می شوند به طوری که در بدن جانداران، محیط های کشت غنی و c370 به فرم مخمری و در خارج از بدن جانداران، محیط های کشت ساده و دمای اتاق (C270-25) به فرم رشته ای درمی آیند مثل قارچ های دو شکلی هیستوپلاسما کپسولاتوم و اسپوروتریکس شنکئی.
درقارچ های دیمورفیک Dimorphic فرم مخمری بیماریزا است درصورتی که درمخمرها فرم رشته ای بیماریزا است.

کلنی قارچها

-1ماکروسکوپی کلنی رشته ای: به فرم های پنبه ای، پرزی، پشمی، مخملی و

کرکی در رنگ های مختلف.
کلنی مخمری: نرم، خامه ای، سفید یا کرم رنگ با رشد سریع.

2-میکروسکوپی کلنی رشته ای: سلولهای مکعبی به دنبال هم به نام Hyphae.
کلنی مخمری : سلول های گرد یا بیضی شکل، با جوانه یا بدون
جوانه.
ساختمان میکروسکوپی قارچ های رشته ای ساپروفیت:
الف- هیفومیست های شفاف (Hyaline) که به دو دسته تقسیم می شوند:
- هیفومیست های شفاف با تیغه میانی: (Septate hyphae)
- هیفومیست های شفاف بدون تیغه میانی: (Non septate hyphae)
ب- هیفومیست های تیره (رنگی) با تیغه میانی: دماشیاسئوسیافائوهایفومایست ها Dematiaceous

 

 

ساختمان اندامهای رویشی قارچ ها :

اندام های رویشی در قارچ های رشته ای در محیط رشد به اشکال مختلفی دیده می شوند که معرف قارچ ها می باشند.

1.میسلیوم راکتی فرم “Racqet mycelium” این نوع میسلیوم در درماتوفیت ها شایع می باشد.

2.اجسام گره ای “Nodular organ”

3.فنری فرم ” “Spiral

4.مارپیچی فرم ” Coil“

5.اجسام شانه ای (دندانه ای) فرم ” “Pectinal

6.اجسام ریشه ای فرم ” ریزوئید“

7.Stolon :هایف های کمانی شکل بین دو ریزوئید را گویند.

8.شاخ گوزنی ” “Chandelier

9.کلامیدوکونیدی :Chlamidoconidia فرم مقاوم قارچ ها وقتی که در شرایط نامساعد قرار می گیرند. (فرم خفته)

 

 

تشخیص آزمایشگاهی چند قارچ

تشخیص آزمایشگاهی کریپتوکوکوس نئوفورمنس ( Cryptococcus neoformans)

كریپتوكوكوزیس از بیماریهای قارچی فرصت طلب است كه عامل آن Cryptococcusخصوصا گونه C. neoformans میباشدو این قارچ تنها قارچ كپسولدار است كه كپسول آن از جنس پلی ساكارید بوده و در بیماریزایی آن نقش دارد

آزمایش مستقیم| نمونه ها (خلط، CSF) را با یک قطره از مرکب چین در زیر میکروسکوپ مشاهده می کنند، یک نمونه را با سرم فیزیولوژی بعنوان شاهد ترکیب می کنند. این قارچ شکل سلول های مخمری را دارد که به وسیله کپسول پلی ساکاریدی احاطه می شود در صورت وجود کپسول تشخیص به راحتی انجام خواهد شد.

 

 

شوره سر یا Pityrosporosis

همانطور که میدانید بیماریهای ناشی از قارچها بر خلاف سایر میکروارگانیسمها خطرناک نیستند و اغلب به جای اینکه از انها با نام بیماری یاد شود بیشتر اختلال در زیبایی یاد میشود . چون بیشتر مشکلاتی که قارچها (به ویژه قارچهای سطحی Superficial Mycosis) ایجاد میکنند در سطح شاخی شده پوست قرار دارند و در بیشتر مواقع به علت تغییر رنگ و یا مشکلی خاصی که در روی پوست ایجاد میکنند فرد را وادار به واکنش میکند .

یکی از بهترین نمونه ها ، شوره سر است که شاید هر انسانی در طول عمر خود مدتی را با ان سرو کله شده باشد . عامل شوره سر مخمری لیپوفیل به نام مالاسزیا اوالیس(Malassezia ovalis) - پیتروسپروم اوال(Pityrosporum ovale ) - است که فلور 90-70 درصد اپیدرم پوست افراد میباشد .

نحوه عمل این مخمر به این صورت است که قارچ در سر سبوم را به اسیدهای چرب تبدیل میکند چون این مخمر برای ادامه حیات به اسیدهای چرب به ویژه اسید اولئیک نیاز دارد و این امر سبب افزایش میتوز سلولهای اپیدرمی میشود که ادامه این عمل شوره سر را به دنبال خواهد داشت . در بیشتر افراد واکنش ازدیاد حساسیت به علت فراورده های قارچی هم دور از ذهن نیست .

افزایش ترشحات غدد چربی ساز پوست سر مهمترین عامل زمینه ساز بیماری است . و در هر دو جنس زن و مرد یکسان دیده میشود و باعث خارش و ریزش موها میشود .

تشخیص
میکروسکوپی : به شکل سلولهای مخمری بیضی منفرد یا خوشه دار در میان سلولهای اپیدرم
ماکروسکوپی : به علت مخمر بودن فاقد میسیلیوم است . و در محیط کشت که حاوی اسید چرب اولئیک باشد رشد میکند .

برای تشخیص این قارچ از روشهای گوناگونی استفاده میکنند یکی از این روشها استفاده از لامپ وود است که کونیدی ها را به صورت فلورسانس زرد طلایی نشان میدهد . با مشاهده این رنگ زرد با بیستوری از ضایعه نمونه برداری می کنیم و در زیر میکروسکوپ بررسی میکنیم .
برای برسی میکروسکوپی میتوان از هیدروکسید پتاسیم 10 درصد ، کریستال ویوله ، لاکتو کاتن بلو و یا ید استفاده کرد . از انجا که با مشاهده میتوان این قارچ را تشخیص داد در آزمایشگاه نیازی به کشت نیست اما در شرایط استثنایی که افتراق قارچها (مانند بیماری برص ، ماسک حاملگی ، اریتراسما و ..)در نظر است باید کشت انجام گیرد .

درمان
ممکن است شایعات به صورت خود به خودی از بین بروند ولی عوامل کراتولیتیک موثر خواهد بود . داروی انتخابی در بیشتر اوقات تیوسولفات 25 درصد و اسید سالسیلیک 1 درصد در الکل ایزوپروپیل 10 درصد و پروپیلن گلیکول است . در بیشتر افراد قرص کتوکونازول به مدت سه هفته در پروسه درمان استفاده میشود

همه چیز در مورد سیستم ایمنی و روش الیزا

به تمام موادی که قادر باشند سیستم ایمنی بدن را تحریک و وادر به پاسخگویی نمایند آنتی ژن می نامند . قدرت آنتی ژن ها در تحریک سیستم ایمنی به عوامل مختلفی بستگی از جمله جنس ٬ وزن مولکولی – ساختمان فضایی و تعداد جایگاه های آنتی ژنیک آن مربوط می شود این جایگاهها یا شاخص های آنتی ژنیکی را روی یک مولکول اپی توپ نیز می نامند که مناطقی هستند از یک مولکول که قدرت آنتی ژنیکی یا تحریک سیستم ایمنی را دارند .

آنتی ژنها انواع مختلفی دارند آنتی ژن را اختصارا بصورت Ag نشان می دهند .

ایمونوگلوبین ها :

ایمونوگلوبین ها مولکولهایی هستند که به طور اختصاصی بر علیه آنتی ژن ها و در اثر تحریک آنها ترشح می شوند . ایمونوگلوبین ها در اکثر مایعات بدن از خون و پلاسما تا ترشحات خارج بدن وجود دارند . ساختمان این ملوکولها گلیکوپروتئینی است که بطور اختصار بصورت Ig نشان داده می شوند دارای چهار زنجیره است با دو زنجیره کوتاه و دو زنجیره بلند که از قسمت انتهای بازوهای دو زنجیره تغییر پذیر قدرت اتصال به آنتی ژن را دارد . جایگاه اتصال با آنتی ژن ٬ پاراتوپ نامیده می شود .

هر پاراتوپ مخصوص اپی توپ خاصی طراحی می شود . بقیه قسمت های مولکول ایمونوگلوبولین تقریبا ثابت می باشد اما بر اساس تفاوت های کلی همین قسمت پنج نوع ایمونوگلوبولین مختلف در بدن هر انسان وجود دارد که بنام IgA ٬ IgH ٬ IgM ٬ IgD و IgE نامیده می شوند که هر کدام خصوصیات متفاوتی دارند . ایمونوگلوبولینی که اختصارا بر علیه یک اپی توپ ساخته شده باشد ٬ آنتی بادی نامیده شده و آنرا با Ab نشان می دهیم .

واکنشهای آنتی ژن آنتی بادی :

آنتی بادی ساخته شده بر علیه یک آنتی ژن قدرت اتصال به آن آنتی ژن را دارد پس اگر در سرم فردی ٬ بر علیه آنتی ژنی خاص ٬ آنتی بادی وجود داشته باشد ٬ دلیل بر ابتلا فرد به آن بیماری می باشد پس جهت اطلاع از بیماری یک فرد کافی است سرم فرد را مقابل آنتی ژنی مربوطه ( که معمولا بصورت کشته شده و آماده در دسترس می باشد ) قرار دهیم . اتصال آنتی ژن به آنتی بادی سرم ٬ تشکیل مجموعه یا کمپلکس ایمنی را می دهد که درشت بوده و قابل بررسی است .

رابطه Ag + Ab => AgAb اساس تشخیصی بسیاری از تست های ساده و پیشرفته ایمونولوژی می باشد کافی است تا از وجود کمپلکس ایجاد شده مطمئن شویم . گاهی کمپلکس ایجاد شده درشت و قابل رویت نیست و باید از مواد دیگری که به Ag یا آنتی بادی متصل می کنیم بوجود آن پی ببریم برخی از این مواد ٬ فلورسان هستند که از خود نور ساطع می کنند برخی نیز رادیواکتیو بوده و حضور مقدار اندکی از آنها در کمپلکس به سادگی قابل بررسی می باشد . به هر حال حضور ایمیون کمپلکس دلیل وجود آنتی بادی است در همین رابطه تست های مختلفی با نام های متفاوت برای تشخیص آنتی ژن ها ٬ سلول ها و یا سایر اجزاء سلولی بکار گرفته می شود که اساس آزمایش های سرولوژی و ایمونولوژی با نام های مختلف می باشد.

ایمونوهماتولوژی :

در این قسمت آنتی ژن هایی که بر روی گلبول های قرمز قرار داشته و اساس تقسیم بندی آنها را به چهار گروه اصلی O ٬ AB ٬ A ٬ B و همجنین آنتی ژن های Rh بررسی می شود .آنتی بادی ساخته شده بر علیه آنها چگونگی تعیین گروه خونی و آنتی ژنهای فرعی گروههای خونی را بررسی می نماید علاوه بر آن ناسازگاری هایی که در انتقال خون پیش می آیند روش های جلوگیری از این اتفاق و ناسازگاری های مادر و جنین مورد بررسی قرار می گیرد.

کمپلمان یا مکمل :

مجموعه پروتئینی دیگری در خون و پلاسما و مایعات و ترشحات بدن وجود دارد که به نام کمپلملن یا مکمل نامیده می شود . در واقع این مجموعه پروتئینی تکمیل کننده واکنشهای آنتی بادی است اگر آنتی بادی ترشح شده بر علیه آنتی ژن محلول ساخته شده باشد با اتصال به آن باعث تخریب و حذف آن خواهد شد . اما اگر آنتی ژن مربوطه یک میکروارگانیسم ( میکروب ٬ویروس و یا سلول ) باشد اتصال آنتی بادی به آنتی ژن باعث ظاهر شدن جایگاه هایی می شود که می تواند کمپلمان را جذب نماید . مجموعه پروتئینی کمپلمان بر خلاف آنتی بادی غیر اختصاصی است و به صورت غیر فعال می باشد اما اگر فعال شود اجزای آن یکی بعد از دیگری یکیدگر را فعال می نمایند ( کمپلمان را باC نشان می دهند ) اجزای اصلی آن را بصورت C1 – C9 نشان داده می شود . اولین جزء کمپلمان قادر است به قسمتی از مولکول آنتی بادی که به آنتی ژن متصل شده بچسبد نهایتا فعال شدن پشت سرهم اجزاء کمپلمان ٬ منجر به تشکیل مجموعه ای شبیه به قیف روی سطح پاتوژن ( عامل بیماریزا ) می شود که منجر به نابودی آن خواهد شد.

سیستم HLA

سازمان دهی ژنتیکی

HLA – Major Histocompatibility Complex

کار اصلی سلول های T دفاع در برابر میکروب های داخل سلولی و فعال کردن سایر سلولها مانند ماکروفاژ ها و لنفوسیت های B است . این اعمال لنفوسیت های T نیازمند تعامل با سایر سلول ها است که ممکن است سلول میزبان ، ماکروفاژ ها ،سلول های دنریتیک و یا لنفوسیت های B را الوده شده باشند .سلول های T این قابلیت را دارند که با سلولهای دیگر تعامل برقرار کنند چون گیرنده های آنتی ژنی سلولهای T تنها آنتی ژن هایی را شناسایی میکنند که بر روی سلولهای دیگر نمایش و یا به عبارتی عرضه شده باشند . این ویژگی سلول های T در تضاد با مواد ترشحی لنفوسیت های B یعنی آنتی بادی ها است چون آنتی بادی ها آنتی ژن های محلول و همچنین سلولهای مرتبط با آنتی ژن را شناسایی میکنند. این عمل ، یعنی عرضه آنتی ژن توسط سلول برای شناسایی توسط لنفوسیت های T ، توسط پروتئین های تخصصی ای انجام می شود که توسط لوکوسی کد دهی میشود که به آن MHC می گویند .

MCH ، به عنوان لوکوس ژنی بسیار طولانی ای کشف شد که بسیار پلی مرفیس است و در نتیجه پیوند اعضا بین افراد کشف شد . امروزه ما میدانیم که نقش فیزیولوژیکی مولکولهای MCH ، عرضه آنتی ژن به سلول های T است. در حقیقت مولکول های MCH ، ترکیبات جدائی ناپذیر لیگاندهایی هستند که بیشتر سلولهای T آنها را شناسایی میکنند چون گیرنده های آنتی ژنی سلولهای T ، برای مولکول های MCH خودی و آنتی ژنی های پپتیدی خارجی ، اختصاصی هستند..

دو نوع اصلی یا کلاس محصول ژن های MCH هست :

1. مولکولهای MCH کلاس یک
2. مولکولهای MCH کلاس دو

سلول های MCH1 ، آنتی ژن های پپتیدی را به لنفوسیت های CD8+ یا سیتولیتیک عرضه میکنند و سلولهای MCH2 هم آنتی ژنهای پپتیدی را به سلولهای T HELPER ، CD4+ عرضه میکنند. بنابراین اگاهی از ساختار و بیوسنتز مولکولهای MCH و ارتباط آنتی ژن های پپتیدی با مولکولهای MCH ، برای درک این نکته که سلولهای T چگونه آنتی ژن های بیگانه را شناسایی میکنند اساسی است .

ما بحث خود را در ادامه مطلب با بررسی ساختار MCH ، بیوشیمی پپتید اتصالی به MCH و ژنتیک MCH ادامه میدهیم. اصطلاحات و ژنتیک MHC با دید تاریخی قابل درک بهتری است بنابراین ما بحث خود را با چگونی کشف MCH ادامه میدهیم .

کشف MCH و نقش آن در پاسخ ایمنی بدن

MHC ، به عنوان لوکوس ژنتیکی ای کشف شد که محصولات ان مسئول رد پیوند بین گونه های خالص موش بودند. کلید اساسی برای درک MHC، دانستم مفهوم پلی مورفیس ژنتیکی است . بعضی از ژن ها تنها با یک توالی اسید نوکلئیک طبیعی در تمام اعضای یک گونه (به جز جهش در سایر سرایط نسبتا نادر است) بیان میشوند که به این ژنهای غیر پلی مورفیس میگویند که توالی ژن نرمال و یا معیوب در هر دو کروموزم جفت در بین اعغلب اعضای گونه دیده میشود . اما در مورد دسته دیگر ژنها، فرم های جایگزین و یا واریانتها در فرکانسهای پایدار در بین اعضای جمعیت دیده میشودبه این ژنها پلی مورفیس می گویندو هر یک از این واریانت ها و یا فرمهای جایگزین را الل میگیوند . یک فرد میتواند یک الل را در هر دو کروموزم جفت خود داشته باشد در این صورت به این ژنها هموزیگوت اطلاق می شود ولی ممکن است در لوکوس ژنتیکی دو کروموزم جفتی ، آلل ها با هم یکی نباشند در این صورت به فرد هتروزیگوت اطلاق میشود.

در سال ۱۹۴۰ ، جرج اسنیل و همکارانش با استفاده از تکنیک های ژنتیکی به بررسی رد پیوند تومور و سایر اعضا در موشهای ازمایشگاهی پرداختند. برای این منظور تولید تهیه گونه های خالص موش لازم بود که با جفت گیری از خواهر و برادر به دست امد . بعد از ۲۰ نسل ، هر عضوی از گونه های خالص ، در تمام لوکوسهای کروموزمی خود ، توالی یکسان اسید های نوکلوئیک را به دست اوردند. به عبارت دیگر ، موشهای خاصل در تمام لکوسهای ژنتیکی هموزیگوت شدند و هر موش خالص از گونه با موش همان گونه از نظر ژنتیکی (سینرژیکی) یکسان شدند.در مورد ژن های پلیمورفیس ، باید بگیم که با توجه به منشا موش های خالص هر گونه ، یک نوع الل را بیان میکنند و ممکن است گونه دیگر الل دیگر را بیان کند که در این صورت به اصطلاح به این دو گونه آلوژنیک هم میگویند.

زمانی که یک بافت و یا عضوی از یک حیوان به حیوان دیگر مانند پوست پیوند داده میشود دو حالت ممکن است اتفاق بایفتد.

در یک حالت ، پوست پیوند داده شده به حیات خود در میزبان جدید ادامه میدهد و مشکلی پیش نمی آید و در حالت بعدی ، سیستم ایمنی میزبان بافت پیوندی را تخریب میکند که به این فرایند دفع پیوند می گویند. تجربیات پیوند پوست نشان میدهد که پیوند پوست بین اعضای یک گونه خالص شده امکان پذیر است در حالی که همین پیوند بین دو گونه خارجی رد میشود . بنابراین شناخت سولهای خودی از غیر خودی به صورت ارثی بین نسلها انتقال میابد .

آزمایش الایزا

سیستم الایزا به طور خلاصه شامل مراحل زیر است:

- جذب آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی به یك فاز جامد كه فرآیند كوتینگ نامیده می‌شود.

- اضافه نمودن نمونه‌ی تست و یا معرف‌های دیگر نظیر استانداردها.

- انكوباسیون و انجام واكنش‌ها.

- جداسازی واكنش‌دهنده‌های آزاد از آن‌هایی كه به فاز جامد متصل شده‌اند بوسیله‌ی شست‌وشو

- اضافه‌كردن معرف نشان‌دار شده با آنزیم كه به كونژیوگه معروف است.

- جداسازی كونژیوگه‌های اتصال یافته از نوع آزاد توسط شست‌وشو.

- اضافه كردن سیستم نمایان‌گر كه در حقیقت سوبسترای كروموژن آنزیم است و منجر به تشكیل رنگ شد.

- قرائت چشمی یا طیف‌سنجی.

فرآیند كوتینگ (Coating):

كوتینگ شامل برهم‌كنش سطح فاز جامد و معرص‌های ایمنی است. این برهم‌كنش‌ها وابسته به فاكتورهای متعددی است از جمله میزان انتشار و ژئومتری فاز جامد، زمان، غلظت، وزن ملوكولی، درجه حرارت و خصوصیات شیمیایی سطح فاز جامد و معرف است.

فاز جامد:

رایج‌ترین نوع فاز جامد در روش الایزا پلیت‌های 96 خانه‌ای است كه از ماده‌ی پلی‌وینیل كلراید (با قابلیت انعطاف) و یا پلی‌استیرن (غیرقابل انعطاف) تهیه شده‌اند. به طور ایده‌آل چاهك‌های ته‌صاف برای قرائت اسپكتروفتومتری در سنجش‌هایی كه در آن‌ها پیشرفت رنگ وجود دارد، پیشنهاد می‌شود.

معرف‌های ایمنی:

اغلب موادی كه باید به سطح فاز جامد اتصال یابند پروتئینی هستند. آنتی‌بادی‌ها در روش سنجش دوجایگاهی ساندویچی و یا در روش رقابتی برای تشخیص آنتی‌ژن به سطح جامد اتصال می‌یابند. در سنجش‌های دوجایگاهی، آنتی‌بادی كه كوت می‌شود باید از میل تركیبی بالایی برای آنتی‌ژن برخوردار باشد.

روش‌های اتصال:

روش‌های مختلفی برای تهیه‌ی فاز جامد وجود دارد كه به طور كلی در سه گروه طبقه‌بندی می‌شوند.

الف) روش‌های مستقیم یا غیركووالان:

در این روش كه به نام روش جذب غیرفعال نیز نامیده می‌شود، ملوكول پروتئینی كه ممكن است آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن باشد از طریق اتصال غیركووالان و به طور كاملاً غیرفعال جذب فاز جامد می‌شود كه یك فرآیند خودبه‌خودی و طبیعی است.

ب) روش‌های غیرمستقیم:

اتصال غیرمستقیم آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن به فاز جامد از طریق یك آنتی‌بادی ثانویه، پروتئین A یا G و یا استرپتاویدین انجام می‌شود. ابتدا این ملوكول‌ها به فاز جامد به طور غیركووالان اتصال می‌یابد و سپس آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن به طور اختصاصی به آن‌ها متصل خواهد شد. این روش دارای محاسنی از جمله قابلیت تكرارپذیری بالا، حساسیت و اختصاصیت مناسب است و ضرورتی برای استفاده از یك آنتی‌بادی خالص و گران‌قیمت وجود ندارد و كارایی كوتینگ نسبت به روش مستقیم بالاتر است.

ج) روش‌های اتصال كووالان:

كوشش برای رفع محدودیت‌های دو روش فوق و فراهم‌سازی نتایج قابل پیشگویی‌تر منجر به پیشرفت و تولید پلیت‌هایی شد كه سطح آن‌ها به طور شیمیایی فعال شده بود. در برخی موارد اتصال یك پلی‌ساكارید و یا یك پلی‌آكریل آمید كه به طور طبیعی به سطوح پلی‌استیرن جذب نمی‌شوند از طریق اتصال كووالان انجام می‌شود.

غلظت (Consenteration):

درك این مسأله بسیار مهم است كه سطوح پلاستیكی دارای یك ظرفیت مشخص برای جذب هستند و این ظرفیت دقیقاً توسط ماهیت پروتئین متصل شده به آن‌ها مشخص می‌شود. بدیهی‌ترین و متغیرترین موضوع در كوتینگ، غلظت مورد استفاده برای كوت كردن پلیت است، چرا كه فاز جامد فقط ظرفیت محدودی برای اتصال دارد. بنابراین تعیین غلظتی كه در آن غلظت سطوح فاز جامد اشباع می‌شود بسیار ضروری است. غلظت مناسب آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی برای كوتینگ در هر سیستم بوسیله‌ی یك روش تیتراسیون تعیین می‌شود. اگر غلظت آنتی‌بادی اتصال یافته به سطح فاز جامد به بیش از غلظت مجاز برسد در این صورت اتصالات دولایه‌ای و چندلایه‌ای ناپایدار تشكیل خواهد شد.

بافر كوتینگ (Coating buffer):

بافرهایی كه به طور شایع در كوتینگ پروتئین‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارت‌اند از:

- بافر كربنات بیكربنات 50 میلی‌مولار با 6/9=pH

- بافر تریس هیدروكلراید 2 میلی‌مولار با 5/8=pH

- بافر فسفات 10 میلی‌مولار با 2/7=pH

به طور معمول برای كوتینگ پروتئین‌ها به فاز جامد پلی‌استیرن از بافر كربنات- بیكربنات استفاده می‌شود.

درجه‌ی حرارت و زمان كوتینگ:

سرعت و میزان كوتینگ وابسته به فاكتورهایی از جمله ثابت انتشار ملوكول اتصال یابنده، نسبت سطح كوتینگ به حجم محلول كوتینگ، غلظت ماده‌ی اتصال یابنده، درجه حرارت، زمان و... است كه این فاكتورها به هم پیوسته‌اند. به دلیل این كه اتصال پروتئین بر روی یك سطح پلاستیكی یك فرایند كنترل شده از نظر انتشار است، باید زمان كافی برای اشباع شدن سطح فاز جامد وجود داشته باشد. زمان مورد نیاز برای كوتینگ به غلظت پروتئین اتصال یابنده و درجه‌ی حرارتی كه كوتینگ در آن انجام می‌شود بستگی دارد. افزایش درجه‌ی حرارت ممكن است یك اثر زیان‌بار بر روی آنتی‌ژن داشته باشد. كوتینگ می‌تواند در حرارت 37 درجه به مدت یك تا دو ساعت كامل می‌شود و انكوباسیون كوتاه‌تر اغلب منجر به یك كوتینگ غیرمتعادل در پروتئین می‌شود.

فرایند بلاكینگ (Blocking):

زمانی كه یك محلول پروتئینی به فاز جامد متصل می‌شود به دلیل اندازه‌ی ملوكول و ممانعت فضایی ایجاد شده ممكن است برخی نواحی از فاز جامد خالی مانده باشد كه این امر با شست‌وشوی بعد از كوتینگ بیش‌تر نمایان می‌شود. این فضا مكان مناسبی برای اتصال عوامل غیراختصاصی در طی سنجش است. برای جلوگیری از اتصالات غیراختصاصی كه خود ایجاد نوعی سیگنال می‌كند پس از كوتینگ یك مرحله‌ی دیگر وجود دارد كه طی آن مكان‌های اشغال نشده توسط ملوكول‌های پروتئینی اصلی، توسط یك پروتئین خنثی پر می‌شود. این بافر مسدودكننده باید دارای ویژگی‌هایی باشد از جمله:

- باید بتواند به تمام نقاط باقی‌مانده و كوت نشده متصل نشود.

- نباید در طی فرایند بلاكینگ جانشین ملوكول‌های از قبل اتصال یافته شود.

- نباید خصوصیات ایمنی ملوكول اتصال یافته را تغییر دهد.

- باید از نظر واكنش خنثی باشد.

- با سیستم سیگنال‌دهنده تداخل نداشته باشد.

مواد بلوك‌كننده‌ای كه به طور معمول مورد استفاده قرار می‌گیرند در سه گروه جای دارند:

- پروتئین‌ها - مواد غیرپروتئینی - دترژنت‌ها

پروتئین‌ها مؤثرترین مواد بلاك‌كننده هستند چرا كه به نظر می‌رسد اثر آن‌ها پایدارتر است. آلبومین سرم گاوی (BSA) رایج‌ترین بلاك‌كننده است. این معرف برای اغلب سنجش‌ها نتایج قابل قبولی داشته و ارزان‌قیمت بوده و به آسانی در دسترس است.

شست‌وشو و بافر شست‌وشو (Washing and Wash Buffer):

شست‌وشوی فاز جامد پس از كوتینگ و در پایان مراحل اضافه نمودن نمونه و ماده‌ی نشان‌دار آنزیمی انجام می‌شود. معرف از شست‌وشو پس از كوتینگ، حذف اتصالات است. ملوكول كوتینگ به فاز جامد بوده و در سایر موارد، هدف جداسازی معرف‌های آزاد از معرف‌های اتصال‌یافته به فاز جامد است. مرحله‌ی شست‌وشو به دنبال خالی نمودن چاهك‌های پلیت از معرف‌های اضافه شده و اضافه نمودن یك محلول شست‌وشو به داخل چاهك انجام می‌شود. محلول استفاده شده یك محلول بافری است و به طور معمول از بافر فسفات سلین 1/0 مولار با 4/7=pH استفاده می‌شود. نمك اضافه شده به محلول به منظور تنظیم قدرت یونی است. به محلول شست‌وشو درصدی از یك ماده‌ی دترژنت اضافه می‌كنند كه مناسب‌ترین غلظت آن حدود 02/0 تا 1/0 درصد است. توئین‌ 20 یك دترژنت ضعیف و ترایتون یك دترژنت قوی است. قدرت یونی و میزان دترژنت موجود در معلول شست‌وشو بسیار حائز اهمیت است. اگر قدرت یونی یا غلظت دترژنت زیاد باشد، باعث شكسته شدن اتصالات اصلی و جدا شدن ملوكول از فاز جامد می‌شود و یا باعث تخریب ملوكول كوت شده می‌گردد.

وجود دترژنت در محلول شست‌وشو باعث تشكیل حباب می‌شود كه اگر محلول خوب تهیه نشود وجود حباب در چاهك باعث به دام افتادن ملوكول‌ها و كاهش سطح تماس چاهك می‌شود و محلول شست‌وشو نمی‌تواند به خوبی با چاهك تماس یابد. در تعدادی از سنجش‌ه از آب شیر به عنوان محلول شست‌وشو استفاده می‌شود ولی توصیه نمی‌شود.

آماده‌سازی نمونه و استانداردها:

یكی از مهمترین خطاهای بالقوه مؤثر در روش‌های سنجش مربوط به خود سنجش نمی‌باشد بلكه مربوط به جمع‌آوری و نگه‌داری نمونه‌هاست.

نمونه‌های با غلظت بالا برای یك اندازه‌گیری صحیح و دقیق در محدوده‌ای از منحنی استاندارد باید رقیق شوند.

طبقه‌بندی الایزا:

1) الایزای مستقیم (Direct ELISA):

در این روش آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی موجود در نمونه كه باید تشخیص داده شود به طور مستقیم بر سطح فاز جامد كوت می‌شود و سپس آنتی‌بادی یا آنتی‌ژن مكمل آن كه نشاندار شده است به سیستم اضافه می‌شود. در صورت وجود آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی مورد نظر در نمونه سیگنال مناسب ایجاد می‌شود. این روش بیش‌تر در كارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود.

2) الایزای غیرمستقیم (Indirect ELISA):

این روش برای تعیین آنتی‌بادی اختصاصی و یا تیتراسیون آنتی‌بادی در نمونه‌های سرم مورد استفاده قرار می‌گیرد. اساس آزمایش به این صورت است كه معمولاً سرم رقیق شده به آنتی‌ژن‌های كوت شده در فاز جامد اضافه می‌شود. آنتی‌ژن كوت شده، آنتی‌ژن اختصاصی مربوط به آنتی‌بادی است كه قرار است در نمونه ردیابی شود، پس از افزودن نمونه و طی زمان انكوباسیون و یك مرحله شست‌وشو آنتی‌هیومن گلوبولین نشان‌دار شده با آنزیم به چاهك اضافه می‌شود.

3) الایزای ساندویچ:

الف: (روش Ag Capture یا Ab Sandwich):

در این روش یك آنتی‌ژن در بین دو آنتی‌بادی اختصاصی قرار می‌گیرد، این روش شایع‌ترین روش الایزا محسوب می‌شود. در این روش از یك آنتی‌بادی برای به دام انداختن آنتی‌ژن بر روی چاهك‌های الایزا استفاده می‌شود و آنتی‌بادی دوم كه با آنزیم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می‌كند. قابل ذكر است كه در این روش آنتی‌ژن باید دارای دو ناحیه آنتی‌ژنیك متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر دو آنتی‌بادی باشد. در مورد TSH، LH، HCG و FSH از این روش استفاده می‌كنیم.

ب: (روش Ab Capture یا Ag Sandwich):

در این روش آنتی‌بادی را مورد سنجش قرار می‌دهیم بدین صورت كه از یك آنتی‌ژن كوت شده بر روی فاز جامد برای به دام انداختن آنتی‌بادی اختصاصی آن استفاده می‌شود و همان‌ آنتی‌بادی از طریق بازوی دیگر خود (Fab) پذیرای همان آنتی‌ژن اما به صورت نشان‌دار می‌باشد در نتیجه آنتی‌بادی اختصاصی در بین دو آنتی‌ژن قرار می‌گیرد در مورد پلاسمودیوم ویواكس، تروپونماپالیدوم و... از این روش استفاده می‌كنیم.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay):

- این تست یكی از تست‌های روتین استفاده شده در آزمایشگاه‌های سرولوژی می‌باشد و اساس كار آن بر پایه‌ی واكنش بین آنتی‌ژن و آنتی‌بادی می‌باشد. این آزمایش را به روش‌های مختلفی از جمله الایزای مستقیم، الایزای غیرمستقیم، الایزای ساندویچ و الایزای رقابتی یا مهاری می‌باشد. كیت مخصوص الایزا شامل دو ردیف 8 و 12 چاهكی است پس در نهایت شامل 96 چاهك می‌باشد. برای انجام تست الایزا به مواد و وسایلی نیازمندیم از جمله:

- كیت 96 خانه‌ای منخصوص الایزا

- كربنات كوتینگ بافر

- بافر بلاك‌كننده

- واشینگ بافر (T.S.T)

- سیترات بافر و سوبسترا

تذكر: مهمترین مرحله در آزمون الایزا محلول‌سازی می‌باشد.

روش تهیه‌ی كربنات كوتینگ بافر:

59/1 گرم! Na₂CO₃

39/2 گرم! NaHCO₃

L 1! H₂O

pH ! 6/9

روش تهیه‌ی بافر شست‌وشو (T.S.T):

تریس 2 مولار با 5/8=pH (ml5 برمی‌داریم).

NaCl 5 مولار (ml30 برمی‌داریم).

20 Tween (ml1 برمی‌داریم).

سپس آن‌ها را در یك لیتر آب مقطر مخلوط می‌كنیم.

روش تهیه‌ی بلاكینگ بافر:

برای این منظور 5 گرم شیرخشك (Skeed milk) را در ml100 بافر T.S.T حل می‌كنیم.

روش تهیه سیترات بافر:

برای این منظور 529 میلی‌گرم سیتریك اسید را در ml50 آب مقطر مخلوط می‌كنیم و با NaCl آن را به 4=pH می‌رسانیم.

روش دیگر به این صورت است كه یك قرص سیترات را در ml100 آب مقطر حل می‌كنیم.

روش تهیه‌ی سوبسترا (ABTS):

در این روش یك قرص ABTS را در ml100 سیترات بافر می‌ریزیم و در مرحله‌ی نهایی 50 پراكسید هیدروژن اضافه می‌كنیم.

تذكر: در آزمون الایزا رقت‌های سرم را در 12 چاهك افقی و غلظت آنتی‌ژن را در 8 چاهك عمودی می‌ریزیم و هرچه از بالا به پایین می‌رویم از رقت و غلظت آنتی‌ژن كاسته می‌شود.

روش انجام كار

100 ماكرولیتر از محلول آنتی‌ژن در كربنات بافر PH=9/6 coating برای هر چاهك ریخته و در دمای 4 درجه یك شبانه یا در دمای اطاق حداقل 3 ساعت نگهداری می‌كنیم پلیت‌ها را 3 بار با (tris washing buffer NaCl+ Tween 20)، شسته هر بار بمدت 5 دقیقه بافر شست‌وشو در چاهك‌ها (به مقدار 200 میكرولیتر) باقی بماند پس از هر بار شست‌وشو پلیت‌ها روی یك سطح صاف كه روی آن دستمال كاغذی گذاشته شده است خشك شود (با ضربه زدن پلیت‌ها روی سطح حجاوی دستمال) پلیت‌ها با بلوك بافر بلوك شوند تا باندهای اضافی ایجاد نشود بلوكینگ بافر skimmed milk (شیر خشك) به مقدار 5 درصد وزنی حجمی در TST(washing Buffer) است كه به مقدار 200 میكرولیتر در هر well ریخته و بمدت یكساعت در دمای اطاق بیا یك شب در 4 درجه نگهداری می‌شود پلیت‌ها سه بار شست‌وشو با محلول شست‌وشو (washing Buffer) سپس سرم مشكوك به همراه كنترل سرم مثبت و منحنی به میزان 100 میكرولیتر به هر چاهك اضافه می‌گردد معمولاً سرم‌ها را به میزان 1:100 در بلوكینگ بافر رقیق و به چاهك‌ها اضافه می‌كنیم پلیت‌ها به مدت یكساعت در دمای اطاق انكوبه شده و سپس 5 بار با محلول شست‌وشو آنها را شست‌وشو داده و بعد آنتی‌بادی دوم كه حاوی كنژوگه است (اصولاً Anti-humen IgG-HRP كونژوگه) را به میزان 1:1000 در محلول TST رقیق كرده و 100 میكرولیتر به هر well اضافه می‌كنیم و بمدت 3 ساعت در دمای اتاق نگهداری می‌كنیم سپس 5 بار با TST شست‌وشو داده و محلول سوبسترا كه در این مورد ABTS (2/2'-azino-di-3-ethilBen2 thiaoline) می‌باشد و معمولاً به شكل قرص است كه هر قرص در 100 میلی‌لیتر نسترات بافر حل می‌شود به مقدار 100 میكرولیتر برای هر چاهك اضافه می‌شود وقتی تغییر رنگ مقایسه شد با كنترل مثبت و منفی یعنی اختلاف رنگ چاهك كنترل مثبت و منفی كاملاً واضح و در بهترین شرایط بود با اضافه كردن 100 میكرولیتر از محلول H₂SO₄ یك نرمال به هر چاهك واكنش را متوقف می‌كنیم و الایزا را در طول موج nm405 با استفاده از الایزا ریدر می‌خوانیم اصولاً برای محاسبه مثبت و منفی‌ها cut oH تعریف می‌كنیم كه برابر است با میانگین OD حدود 20 نفر SD2 و بالای آن را مثبت و مساوی زیر آن منفی تلقی می‌كنیم.

به طور كلی مراحل الایزا عبارت است از:

- كوت كردن آنتی‌ژن به كف پلیت الایزا

- شست‌وشو با استفاده از T.S.T به تعداد 5 بار

- بلاك كردن با استفاده از بلاكینگ بافر

- اضافه كردن سرم انسانی

- شست‌وشو با T.S.T به تعداد 5 مرتبه

- اضافه كردن آنتی‌بادی ثانویه

- شست‌وشو با T.S.T به تعداد 5 مرتبه

- اضافه كردن ماده‌ی رنگ‌زا

- استفاده از محلول متوقف‌كننده برای جلوگیری از ادامه‌ی واكنش

- خواندن ODهای مورد نظر با استفاده از الایزا ریدر در طول موج‌های معین