پلیمرازهای اولیه PCR:

در سال 1983 Kary Mullis از دو پرایمر برای هیبرید کردن هر زنجیره از DNA هدف و اضافه کردن DNA polymerase برای انجام واکنش استفاده کرد که این منجر به همانندسازی DNA به صورت تصاعدی شد. بعد از هر دوره از همانندسازی مخلوط نیاز به حرارت دادن در دمای بالای 90^oC داشت تا DNA تازه تشکیل شده دناتوره گردد. این مرحله حرارت دادن DNA پلیمرازهایی که تا قبل از کشف Taq مورد استفاده قرار می­گرفت یعنی قطعه Klenow از DNA polymerase I از E.coli را غیرفعال می­کرد. علاوه بر آن مقدار جدیدی از آنزیم باید در ابتدای هر چرخه به صورت دستی اضافه شود. با 30-40 چرخه از PCR این کار بسیار پر زحمت و خسته کننده بود. آنچه که نیاز بود یک DNA Polymerase بود که در حین دناتوراسیون DNA که در 90^o C یا بالاتر انجام می­شود پایدار باقی بماند.استفاده از Taq DNA Polymerase مقاوم به حرارت نیاز به اضافه کردن آنزیم جدید به واکنش PCR در ابتدای هر دوره را از بین برد و به علت خصوصیت مقاوم به حرارت بودنش جایگزین DNA Polymerase باکتری E.coli شد.

Taq polymerase :یک پلیمرازمقاوم به حرارت است که بر اساس نام باکتری ترموفیل Thermus aquaticus نامگذاری شد که به طور طبیعی از چشمه های آب گرم جداسازی شد. جداسازی DNA Polymerase از این باکتری بازده PCR را بالا برد زیرا این پلیمراز به سرعت در دمای بالا غیرفعال نمی شود.

Taq اولین آنزیمی بود که قادر بود در شرایط دناتوراسیون (بالای 90^oC ) که برای چرخه PCR مورد نیاز است مقاومت کند. این آنزیم باعث می شود که 30-40 چرخه PCR بدون نیاز به باز کردن واکنش و اضافه کردن پلیمراز جدید انجام شود. بنابراین آلودگی که ممکن است زمان اضافه کردن دستی پلیمراز در یک PCR ایجاد شود را کاهش می دهد. همچنین به دلیل طبیعت ترموفیل بودن باکتری، فعالیت max آنزیم در دمای 70-75^oC است که در آن ساختار دوم DNA الگو به حداقل می­رسد و باعث بازده بالای پلیمریزاسیون می­شود. این آنزیم باندهای یکنواخت­تری نسبت به Klenow می­د هد. همچنین دمای بالا باعث می­شود سکانس­های پیچیده از جمله Hairpin آسان­تر سکانس شوند.

Taq DNA Polymerase محصولات DNAای تولید می­کند که در انتهای ' 3 دارای نوکلئوتید آدنین (اصطلاحا overhang) هستند. این امر برای TA cloning سودمند است که به موجب آن یک cloning vector مانند پلاسمید که در انتهای' 3 دارای نوکلئوتید تیمین است و مکمل overhang A در محصول PCR است قادر است با استفاده از توپوایزومراز یا DNAلیگاز عمل ligation را انجام داده و به انتهای آدنین از محصولات PCR متصل شود.

یکی از مهمترین معایب Taq DNA Polymerase دقت همانند سازی پایین آن است زیرا Taq خاصیت3' → 5' اگزونوکلئازی و مکانیسم proofreading برای جایگزین کردن mismatchهای تصادفی در زنجیره DNA تازه سنتز شده را ندارد و میزان خطای آن 1 در 9000 نوکلئوتید است.. بنابراین Taq اشتباهات بیشتری را نسبت به پلیمرازهای دارای خاصیت proofreading از جمله Pfu ایجاد می کند.

علاوه بر Taq polymerase چندین آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت نیز جداسازی شده است و از ژن های کلون شده بیان شده است.

کاربردهای مهم: PCR

• تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.
• بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
• تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.
• تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماریها:

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدزدر داخل بدن وجود دارد یا نه؟

مشکل PCR و راه حل آن:

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

اطلاعات اولیه:

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.
PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

تاریخچه:

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل PCR :

• مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.
• مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.
• مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.

ادامه PCR بعد از چرخه اول:

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است